تخلیص و تعیین برخی خصوصیات اگزالات اکسیداز جو

دکتر حمیدراهی*؛ دکتر علی مصطفایی**؛ مهندس بیژن نعمانپور***

چکیده

سابقه و هدف: آنزیم اگزالات اکسیداز از پروتئین‌های فاز حاد در گیاهان است که کاربردهای متنوعی در صنعت و پزشکی دارد. در این مطالعه، این آنزیم از ریشه جو خالص شد و بخشی از خصوصیات آن مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها: پس از کشت جو و تهیه عصاره ریشه آن، آنزیم طی مراحل حرارت‌دهی (80 درجه سانتی‌گراد به مدت 3 دقیقه)، رسوب‌دهی با سولفات آمونیوم و در دو مرحله کروماتوگرافی تعویض یون خالص شد. بررسی خلوص و تعیین وزن آنزیم با الکتروفورز در ژل پلی‌اکریل آمید (SDS-PAGE) در شرایط احیایی و غیراحیایی انجام گرفت. تعیین فعالیت آنزیم با روش رنگ‌سنجی و رنگ‌آمیزی اختصاصی در ژل انجام گرفت. برای تعیین نقطه ایزوالکتریک از دو روش ایزوالکتریک فوکوسینگ و کروماتوفوکوسینگ استفاده شد. افزون بر این تأثیر غلظت‌های مختلف اگزالات، غلظت‌های مختلف اوره و تأثیر چند دترجنت در فعالیت آنزیم بررسی گردید. 

یافته ها: وزن آنزیم اگزالات اکسیداز که بیش از 668 بار از ریشه جو خالص شد، در SDS-PAGE احیایی و غیراحیایی به‌ترتیب معادل 26-25  و 120-115 کیلو دالتون بود. شکل تک‌واحدی آنزیم فعالیتی در ژل نداشت و تنها در صورت حفظ ساختمان کامل، آنزیم فعال بود. حداقل دو بخش با نقاط ایزوالکتریک(pI)  مختلف با فعالیت اگزالات اکسیدازی در ریشه جو مشاهده شد.pI   این دو ایزوآنزیم که گزارشی در مورد یکی از آن ‌دو دیده نشده، به‌ترتیب 8/6 و 2/6-6 تخمین زده‌شد. آنزیم خالص‌شده در مقابل انواعی از عوامل واسرشته‌کننده‌ها همچون گرما، غلظت‌های پایین اوره و انواعی از دترجنت‌ها مقاوم بود.

بحث: با اطلاعات بدست آمده از روش تخلیص آنزیم و خصوصیات آن، امکان استفاده از این آنزیم در اندازه گیری اگزالات فراهم شده است.

کلیدواژه‌ها: اگزالات اکسیداز، تخلیص، جو، خصوصیات

« دریافت:  تابستان 1383    پذیرش: تابستان 1384»

* دانشیار بیوشیمی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه

** دانشیار ایمونولوژی، مرکز تحقیقات بیولوژی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه

*** کارشناس ارشد میکروب شناسی، مرکز تحقیقات بیولوژی پزشکی دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه

** عهده‌دارمکاتبات: مرکز تحقیقات بیولوژی پزشکی، سرخه لیژه، بلوار دانشگاه، کرمانشاه. تلفن:4274617-0831

E-mail: amostafaie@kums.ac.ir  

مقدمه

آنزیم اگزالات اکسیداز با نام اختصاری oxo (EC.1|2|3|4) از پروتئین‌های فاز حاد در گیاهان است که در حضور اکسیژن مولکولی، اگزالات را به آب اکسیژنه و دی‌اکسیدکربن تبدیل می‌نماید(1و2). بسیاری از قارچ‌ها پس از آلوده‌کردن گیاه، اگزالات را به‌عنوان ماده سمی تولید می‌کنند. گیاه نیز در پاسخ با استفاده از این آنزیم، اگزالات را تجزیه می‌کند و از محصولات عمل، به‌ترتیب در چرخه کربن و تولید ماده ضدقارچی استفاده می‌کند (4-2). آنزیم اگزالات اکسیداز تاکنون از گیاهان مختلفی از جمله گندم، جو، برنج، ذرت، چغندر قند و علف تلخه جدا و شناسایی شده است. تفاوت انواع ایزوآنزیم‌های این آنزیم در گیاهان مختلف در تعداد اسیدهای آمینه، شرایط واکنش، ساختمان کلی آنزیم و تعداد زیر واحدهای آن می‌باشد(5و6).

 آنزیم اگزالات اکسیداز استفاده‌های متنوع و متعددی در صنایع غذایی، کشاورزی، دامی و پزشکی دارد(16-7). از موارد استفاده این آنزیم در پزشکی، اندازه‌گیری دقیق و کمی سطح سرمی و ادراری اگزالات در بیماران اگزالمیا و بیماران مبتلا به سنگ‌های ادراری می‌باشد (16-14). افزون بر این بحث درمان سنگ‌های کلیوی (17) و هیپراگزالمیای اولیه با این آنزیم یا ژن آن، از مباحث جالب‌توجهی است که در سال‌های اخیر مورد توجه بسیاری قرار گرفته است (18و19). موارد استفاده متعدد آنزیم اگزالات اکسیداز در صنایع مختلف و استفاده از آن در طراحی کیت اندازه‌گیری اگزالات سرم و ادرار، اهمیت تخلیص و تعیین خصوصیات آن را به‌وضوح روشن می‌سازد. در مطالعه حاضر هدف بر ‌آنست که آنزیم با روشی نسبتاً ساده و کم‌هزینه تخلیص و بخشی از خصوصیات فیزیکوشیمیایی آن بررسی گردد. دسترسی به آنزیم خالص، قدم مهمی برای طراحی کیت اندازه‌گیری اگزالات به روش آنزیمی محسوب می‌شود که در مرکز تحقیقات بیولوژیکی در حال انجام می‌باشد. قابل ذکر است که با توجه به مشکلات تخلیص آنزیم اگزالات اکسیداز، این آنزیم معمولاً به‌صورت نیمه‌خالص توسط شرکت‌های مربوطه (همچون شرکت سیگما) عرضه می‌گردد.

مواد و روش‌ها

کشت هیدروپونیک جو: ابتدا مقدار کافی دانه جو با محلول سولفات مس 1/0 درصد (w/v)  به مدت ده دقیقه شسته شد.  سپس در آب شرب به مدت یک شب در دمای آزمایشگاه به صورت غوطه‌ور قرار گرفت. روز بعد دانه‌ها در لای پارچه خیس قرار گرفت و در سبدهای دارای روزنه‌های ریز، در محیط تاریک قرار داده‌شد. ریشه‌ها طی 6-3 روز دو تا سه مرتبه بریده شدند. جوانه‌ها نیز قبل از سبز شدن بریده شد و تا زمان آزمایش در فریزر نگهداری شدند.

استخراج عصاره جو: ریشه یا جوانه با یک حجم آب سرد حاوی فنیل متیل سولفونیل فلوراید (PMSF) یک میلی‌مولار در مخلوط‌کن همگون شد. عصاره از سه لایه صافی پارچه‌ای عبور داده‌شد . محلول حاصل 30 دقیقه در ×g 10000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفوژ گردید و مایع رویی آن جدا و رسوب دور ریخته شد .

تفکیک بخش آنزیمی با کمک سولفات آمونیوم و حرارت: به مایع رویی حاصل از سانتریفوژ، سولفات آمونیوم تا غلظت نهایی 70 درصد اضافه گردید. عصاره 30 دقیقه در×g  10000 در دمای 4 درجه سانتریفوژ شد . رسوب حاصله در حجم کمی بافر فسفات 05/0 مولار با 2/7  pH حل و یک شب در مقابل این بافر دیالیز گردید. محلول دیالیزشده به مدت 3 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه قرار داده شد. سپس در ظرف یخ به سرعت سرد گردید . محلول به مدت 30 دقیقه در

کروماتوگرافی تعویض یون: مراحل نهایی تخلیص شامل کروماتوگرافی تعویض یون در دو ستون دی‌اتیل آمینو‌اتیل سلولز (واتمن) و دی‌اتیل آمینو‌اتیل سفارز (فارماسیا)  بود. ستون شیشه‌ای به ارتفاع 25 و قطر داخلی 2 سانتی‌متر با رزین دی‌اتیل آمینو‌اتیل سلولز
پر گردید و با حجم زیادی از بافر فسفات 05/0 مولار با pH معادل 2/7 شسته شد تا به تعادل رسید.
نمونه پروتئین با غلظت 15- 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر وارد ستون گردید. سپس جریان بافر با سرعت 25 میلی‌لیتر در ساعت بر ستون برقرار گردید. پس از رسیدن جذب خروجی به نزدیک صفر (در طول موج 280 نانومتر) بافر فسفات حاوی شیب خطی تا یک مولار کلریدسدیم در بافر به ستون وارد شد. لوله‌های حاوی آنزیم مخلوط گردید و در مقابل بافر فسفات  005/0 مولار با pH  برابر2/7 دیالیز گردید. سپس به ستون تعویض یون دوم (ستون دی‌آتیل آمینو‌اتیل سفارز) که با همان بافر به تعادل رسیده بود، وارد گردید. پس از رسیدن جذب مایع خروجی ستون به‌نزدیک صفر، شیب غلظت 005/0-05/0 مولار بافر فسفات  با pH برابر 2/7 بر ستون اعمال گردید. لوله‌های حاوی آنزیم مخلوط و محتوای آن‌ها با سولفات آمونیوم در غلظت نهایی 70 درصد رسوب داده شد. رسوب به‌دست آمده با سانتریفیوژ جدا  و در مقابل آب مقطر یا بافرهای مورد نظر دیالیز گردید.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم: اندازه‌گیری فعالیت آنزیم اگزالات اکسیداز بر اساس روش Laker و همکاران (20) با کمی تغییرات انجام گرفت. برای بررسی فعالیت آنزیم میزان پراکسید هیدروژن تولیدشده در واکنش را که باعث تغییر رنگ ماده 3- متیل، 1و2 بنزوتیازولینون هیدرازون(MBTH)  در حضور آنزیم پراکسیداز می‌گردد، اندازه‌گیری شد. محلول واکنش شامل  بافر سوکسینات 50 میلی‌مولار با pH معادل 8/3 حاوی MBTH 003/0 درصد، دی‌متیل آنیلین  (DMA)013 /0 درصد، پراکسیداز 2 واحد در میلی‌لیتر، اگزالات پتاسیم 25/0 میلی‌مولار و 1/0 میلی‌لیتر نمونه آنزیمی در حجم 2/2 میلی‌لیتر بود. پس از گذشت 10 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با افزودن یک میلی‌لیتر محلول متوقف‌کننده (اسید سولفوریک 5 درصد) واکنش، متوقف و جذب آن در طول موج 590 نانومتر اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری غلظت پروتئین: اندازه‌گیری غلظت پروتئین براساس روش برادفورد (21) انجام گرفت. استاندارد مورد استفاده شامل محلول سرم آلبومین گاوی با غلظت‌های20، 40، 60، 80 و 100 میکرو‌گرم در 100 میکرولیتر بافر بود.

الکتـرو‌فورز در ژل پلی‌اکـریل‌آمیـد در حضـور سدیم‌دو‌دسیل‌سولفات (SDS-PAGE): این آزمون به دو شکل احیایی و غیراحیایی بر اساس روش لاملی (22) در ژل جداکننده 10 درصد انجام گرفت‌. یک حجم بافر نمونه (x5) به چهار حجم نمونه اضافه شد و پس از قراردادن آن به‌مدت 5 دقیقه در ظرف آب جوش، 15 میکرولیتر از هر نمونه درون چاهک‌ها ریخته شد.  الکترو‌فورز با ولتاژ ثابت 150 ولت تا رسیدن رنگ نشانگر به انتهای ژل انجام گرفت. پس از الکتروفورز، رنگ‌آمیزی ژل با کوماسی آبی انجام گرفت (23).

بررسی فعالیت اختصاصی آنزیم در ژل: در حالاتی که لازم بود موقعیت آنزیم به‌طور اختصاصی در ژل مشخص گردد، SDS-PAGE در شرایط غیراحیایی انجام گرفت و نمونه آنزیم نیز تحت تأثیرحرارت قرار داده‌ نشد. در این حالت، پس از انجام الکتروفورز،  ژل در بافر تریس 50 میلی‌مولار با pH معادل 5/7 حاوی اتانول 0 درصد به مدت یک ساعت قرار داده شد. حجم مورد نیاز از محلول رنگ‌‌آمیزی (شامل  بافر سوکسینات 50 میلی‌مولار با pH برابر 8/3 حاوی MBTH 003/0 درصد، دی‌متیل آنیلین (DMA) 013/0 درصد، پراکسیداز 2 واحد در میلی‌لیتر و اگزالات پتاسیم 25/0 میلی‌مولار) به سطح ژل افزوده شد. پس از ظاهرشدن باند آنزیم، ژل در آب مقطر شسته ‌شد و از آن تصویر تهیه گردید.

ایزو‌الکتریک فوکوسینگ (IEF): ایزو‌الکتریک فوکوسینگ به روش آبگیری مجدد ژل در آمفولین 9-3 (فارماسیا) بر اساس روش  Allenو Budowle با بعضی تغییرات انجام گرفت (24). پس از قراردادن ژل روی دستگاه، پیش‌فوکو‌سینک به مدت 20 دقیقه در 700 ولت انجام گرفت. سپس 10 تا 15 میکرولیتر از هر نمونه روی کاغذ‌های مخصوص نمونه‌گذاری قرار داده شد. مرحله نفوذپذیری به مدت یک ساعت در شیب ولتاژ 500- 0/0 ولت، مرحله جدا‌سازی در ولتاژ ثابت 2500  ولت به مدت شش ساعت و  مرحله نازک‌شدن باند‌ها نیز در ولتاژ ثابت 3000 ولت به مدت 15 دقیقه انجام گرفت. پس ژل  برای رنگ‌آمیزی غیراختصاصی یا رنگ‌آمیزی اختصاصی به محلول‌های مربوطه منتقل گردید.

کروماتوفوکوسینگ: کروماتوفوکوسینگ در تعویض‌کننده پلی‌بافر94 و پلی‌بافر74 انجام گرفت. ابتدا حجم کافی از ژل در بافر ایمیدازول 25 میلی‌مولار با PH برابر 4/7 شسته شد و در ستونی به ارتفاع و قطر به‌ترتیب 15 و 1 سانتی‌متر ریخته شد. ستون با حجم کافی از بافر ایمیدازول شسته شد تا به تعادل بافری رسید. نمونه پروتئین که یک شب در مقابل بافر ایمیدازول دیالیز شده‌بود، وارد ستون گردید. سپس جریان پلی‌بافر 74 که محلول استوک آن 9بار با آب مقطر رقیق شده و pH آن 4 بود، باسرعت 25 میلی‌لیتر در ساعت بر ستون وارد گردید. خروجی ستون بادستگاه جمع‌کننده فراکسیون جمع‌آوری گردید و محتوای لوله‌ها از نظر pH، میزان پروتئین و فعالیت اختصاصی با روش‌های مربوطه بررسی شد.

اثر اوره و دترجنت‌ها بر آنزیم: برای این کار، ابتدا آنزیم در حضور اوره با غلظت‌های 2،4،6 یا 8 مولار و دترجنت‌های تریتون X-100، توین بیست، چپس و زویترجنت 14-3 با غلظت‌های به‌ترتیب 1، 1، 5/0 و 5/0 درصد برای مدت 2 ساعت در دمای اتاق قرار گرفت. سپس فعالیت هر لوله آزمون  نسبت به لوله کنترل با روش Laker و همکاران که در بخش‌های قبلی توضیح داده‌شد، اندازه‌گیری گردید.

یافته ها

الگوی SDS-PAGE عصاره ریشه جو در شکل 1- الف آمده است. این الگو شامل ده‌ها باند پروتئینی کم‌مقدار است. باند مربوط به موقعیت آنزیم اگزالات اکسیداز نیز درصد ناچیزی را به خود اختصاص می‌دهد. الگوی الکتروفورزی آنزیم خالص‌شده در قسمت‌های ب و ج شکل 1 به‌ترتیب در شرایط احیایی و غیر‌احیایی آمده است. همان‌گونه که این نتایج نشان می‌دهد، وزن آنزیم در شرایط احیایی در محدوده 26-25 و در شرایط غیر‌احیایی در محدوده 120-115 کیلو‌دالتون تخمین زده شده است. در الگوی الکتروفورز احیایی یک باند پروتئینی ضعیف نیز در موقعیت وزنی 26-25 کیلو‌دالتون (معادل وزن آنزیم تک‌واحدی) دیده می‌شود. در شرایط احیایی برای تخمین وزن مولکولی آنزیم تک‌واحدی از چهار پروتئین استاندارد شامل آلبومین سرم گاو، اوآلبومین، بتالاکتوگلوبوبین و آلفا لاکتالبومین به‌ترتیب با اوزان 67، 45، 18 و 4/14 کیلودالتون استفاده شد. در مقابل، در شرایط غیراحیایی برای تخمین وزن مولکولی آنزیم فقط از IgG انسانی با وزن 150 کیلودالتون استفاده شد که به ‌دلیل محدودیت در دسترسی به پروتئین‌های استاندارد با وزن مولکولی بالا بود. 

همان‌گونه که در بخش مواد و روش‌ها اشاره شد، برای تأیید پروتئین خالص‌شده به عنوان آنزیم اگزالات اکسیداز، بخشی از ژل SDS-PAGE غیر‌احیایی به

صورت اختصاصی رنگ‌آمیزی گردید. نتیجه این آزمون نشان داد که پروتئین خالص‌شده موقعیت 120-115 کیلو‌دالتون فعالیت اگزالات اکسیدازی دارد ( شکل1- د).

نتایج ایزوالکتریک فوکوسینگ عصاره ریشه جو و بخش‌های آنزیمی نشان داد که دو باند پروتئینی متفاوت از نظرp?  با فعالیت اگزالات اکسیدازی دیده می‌شود. نقطه ایزوالکتریک باند دارای فعالیت بیشتر در محدوده 8/6-6/6 تخمین زده‌شد. p? باند با فعالیت کمتر اگزالات اکسیداز حدود 6 تخمین زده شد. روش دیگر که برای تعیین p? به‌کار رفت، کروماتوفوکوسینگ در دامنه pH 4 الی 7 بود. شکل 2 کروماتوگرام لوله‌های با فعالیت اگزالات اکسیداز را در این روش نمایش می‌دهد. نتایج این آزمون نشان داد که دو بخش با p? متفاوت دارای فعالیت اگزالات اکسیدازی هستند. این دو بخش که از نظر فعالیت تفاوت قابل توجهی داشتند، به‌ترتیب دارای p? معادل 2/6 و 8/6 بودند. بخش با p? بالاتر، فعالیت آنزیمی بیشتری از خود نشان داد.

شکل1- (د) الگوی SDS-PAGE عصاره ریشه جو در شرایط احیایی (ج) و (ب) الگوی SDS-PAGE آنزیم خالص‌شده به‌ترتیب در شرایط احیایی و غیر‌احیایی. ستون‌های M مربوط به مارکرها وزنی است (الف) الگوی SDS-PAGE غیر‌احیایی آنزیم با رنگ آمیزی اختصاصی

 آنزیم اگزالات اکسیداز خالص پس از قرار‌گرفتن در دمای 80 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه تا 50 درصد فعالیت خود را از دست داد. حرارت 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه کمتر از 20 درصد فعالیت آنزیم را کاهش داد. اثر غلظت‌های مختلف سوبسترای اگزالات پتاسیم در فعالیت آنزیم نشان داد که حداکثر فعالیت آنزیم در محدوده 25/0 تا یک میلی‌مولار اگزالات پتاسیم دیده می‌شود و فعالیت آنزیم در غلظت‌های بالاتر و پایین‌تر از محدوده فوق کاهش می‌یابد.

اثر دترجنت‌ها در فعالیت آنزیم اگزالات اکسیداز نشان داد که دترجنت‌های غیر‌قطبی تریتون x-100 و توین بیست و دترجنت‌های زویتریونی چپس و زویترجنت
14-3 در دمای اتاق تأثیر محسوسی در فعالیت آنزیم ندارد. در حالتی که محلول آنزیم و دترجنت‌های فوق دقایقی در آب جوش یا دمای 80 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد، فعالیت آنزیم متوقف گردید. افزون بر این  نتایج تأثیر غلظت‌های مختلف اوره در آنزیم نشان داد که اگزالات اکسیداز در حضور غلظت 2 مولار اوره برای چندین ساعت فعالیت خود را به‌طور کامل و حتی در غلظت 8 مولار اوره برای مدت یک ساعت، تا 30 درصد فعالیت خود را حفظ می نماید.

بحث

روش آنزیمی با استفاده از اگزالات اکسیداز، در حال حاضر دقیق‌ترین روش برای اندازه‌گیری اگزالات در پلاسما و ادرار است (16). به‌علاوه این آنزیم می‌تواند در درمان سنگ‌های کلیوی(17) و هیپراگزالمیای اولیه (18 و 19) مورد استفاده قرارگیرد. این موضوع اهمیت استخراج و تخلیص آن را از منابع مناسب روشن می‌سازد. در مطالعه حاضر با توجه به سادگی کشت و بالا‌بودن فعالیت مخصوص آنزیم اگزالات اکسیداز، از ریشه جو به عنوان منبع گیاهی تخلیص آنزیم استفاده شد. نتایج نشان داد که این آنزیم با درجه خلوص بالا (شکل1) بیش از 628 بار از عصاره ریشه جو خالص شده است. محصول خالص شده در SDS-PAGE احیایی وزنی معادل 26-25 کیلو‌دالتون (قسمت ب شکل 1) و در SDS-PAGE غیر‌احیایی وزنی معادل 120-115 کیلو‌دالتون (قسمت ج شکل 1) داشت. اگر‌چه وزن واحدهای آنزیمی در این مطالعه، با سایر مطالعات هم‌خوانی دارند، ولی وزن تخمین‌زده‌شده برای آنزیم کامل با نتایج بعضی مطالعات مشابه و بعضی دیگر متفاوت است(27- 25). بدین لحاظ به‌نظر می‌رسد آنزیم خالص ساختمانی 5 واحدی دارد. باید توجه داشت که در SDS-PAGE با تعیین وزن زیر‌واحدها و پروتئین کامل، در بسیاری از حالات نمی‌توان به تعداد زیر‌واحدها پی برد. این موضوع از دلایل عمده گزارش‌های متفاوت مبنی بر 5 یا 6 واحدی‌بودن آنزیم اگزالات اکسیداز است.

در بررسی فعالیت آنزیم در ژل مشخص گردید که شکل تک‌واحدی آنزیم هیچ‌گونه فعالیتی ندارد. این نتایج نشان داد که بر‌هم‌خوردن ساختمان چهارم و شکستن پیوندی دی‌سولفیدی که در طول SDS-PAGE رخ می‌دهد، به جداشدن زیر‌واحدها و متوقف‌شدن فعالیت آنزیم می‌انجامد. Kotsira و Clonis (28) نشان داده‌اند که آنزیم اگزالات اکسیداز ریشه جو 83 درصد فعالیت خود را پس از 5 دقیقه در محلول یک میلی‌مولار مرکاپتواتانل از دست می‌دهد. آن‌ها معتقدند که ساختمان چهارم و فعالیت آنزیم وابسته به پیوندهای دوسولفیدی بین اسیدهای آمینه سیستئین است. این پیوندها در طول SDS-PAGE شکسته می‌شوند.

در این تحقیق مشخص گردید که در ریشه جو حداقل دو ایزوآنزیم اگزالات اکسیداز وجود دارد. یکی از این دو آنزیم که دارای نقطه ایزوالکتریک 8/6 است، از نظر غلظت و فعالیت، میزان بیشتری را به خود اختصاص می‌دهد. Requena و Bornemann در سال 1999 نقطه ایزوالکتریک اگزالات اکسیداز جو را معادل 9/6 گزارش نمودند (29). در مورد ایزوآنزیم دیگر که بخش کمتری از فعالیت اگزالات اکسیدازی را به خود اختصاص می‌دهد و نقطه ایزوالکتریک آن معادل 2/6-6 تخمین زده می‌شود، ظاهراً گزارشی در دست نیست. استفاده از روش کروماتوفوکوسینگ برای یافتن این ایزوآنزیم‌ها در حالت طبیعی و مقایسه نتایج آن با روش ایزوالکتریک فوکوسینگ در مطالعه دیگر دیده نمی‌شود.

در این مطالعه همچنین معلوم گردید که آنزیم اگزالات اکسیداز مقاومت قابل‌توجهی در برابر اوره و انواعی از دترجنت‌های غیر‌قطبی و زویتریونی دارد. Zhang و همکاران (30) نیز نشان دادند که اگزالات اکسیداز جو مقاومت خوبی در مقابل سدیم دودسیل سولفات و اتانل دارد. به همین خاطر آنزیم می‌تواند شرایط بافر نمونه SDS-PAGE غیر‌احیایی در حرارت‌های پایین‌تر از 80 درجه سانتی‌گراد را تحمل نماید و رنگ‌آمیزی اختصاصی آن در ژل امکان‌پذیر است. وجود چنین خصوصیاتی از مزیت‌های قابل‌توجه برای استخراج و کاربرد این آنزیم در صنعت و پزشکی است. امروزه شرکت‌های سازنده کیت‌های سنجش اگزالات، روش‌های مختلفی با استفاده از آنزیم اگزالات اکسیداز جو برای انجام این کار طراحی نموده‌اند یا در حال طراحی آن هستند (19و35-31). این آنزیم به صورت نیمه‌خالص توسط شرکت‌های تجاری همچون شرکت سیگما باهزینه قابل‌توجه به فروش می‌رسد. بااطلاعاتی که از پژوهش حاضر در خصوص تخلیص و تعیین خصوصیات این آنزیم از ریشه جو به‌دست آمده، امکان تخلیص آن در مقیاس کم یا زیاد فراهم شده است. در ادامه پژوهش سعی بر آن است تا شکل خالص‌شده آنزیم به همراه آنزیم پر‌اکسیداز که قبلاً تخلیص شده است(36)، در طراحی کیت اندازه‌گیری اگزالات ادرار مورد استفاده قرار گیرد.

نتیجه گیری:

در مطالعه حاضر روشی نسبتا ساده برای تخلیص آنزیم اگزالات اکسیداز از جوانه جو طراحی گردید و مقاومت آنزیم در برابر انواعی از عوامل واسرشته کننده تعیین شد. درمطالعات بعدی بر آن است که شکل خالص آنزیم در طراحی کیت اندازه گیری اگزالات مورداستفاده قرار گیرد.