تأثیر برخی
فلاونوئیدهای خالص در گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها
در شرایط in
vitro
صدیقه عسگری*؛ غلامعلی نادری**؛ مژگان قاری پور***
چکیده :
سابقه و هدف: گلیکوزیلاسیون غیرآنزیمی پروتئین‌ها علت اصلی مشکلات دیابتی و
همچنین اختلالات قلبی و عروقی، رتینوپاتی، نفروپاتی و نوروپاتی می‌باشد. به‌نظر می‌رسد
آنتی‌اکسیدان‌ها تأثیرات بازدارندة مؤثری بر گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها داشته
باشند.
مواد و روش‌ها: چند نوع فلاونوئید از جمله روتین، کامفرول، کوئرستین، آپی‌ژنین،
نارینجین، مورین، بیوچانین‌آ انتخاب شدند و تأثیرات آنتی‌اکسیدانی آنها تحت شرایط
in vitro
در گلیکوزیلاسیون هموگلوبین، آلبومین و انسولین مورد بررسی قرار گرفت . در ابتدا غلظت مطلوب گلوکز و نیز
زمان انکوباسیون برای هر پروتئین تعیین‌گردید. سپس درصد مهار گلیکوزیلاسیون هر
پروتئین در حضور سه غلظت مختلف (ml/µg
10، 5، 5/0) از هر فلاونوئید با روش اسپکتروفتومتریک تعیین‌گردید.
یافته‌ها: نتایج به‌دست‌آمده نشان
می‌دهد که بیوچانین‌آ بهترین باز دارنده گلیکوزیلاسیون
انسولین و هموگلوبین است، به‌طوری که گلیکوزیلاسیون انسولین را 100% و هموگلوبین
را 60% مهار می‌کند. گلیکوزیلاسیون آلبومین به میزان 100% با بیوچانین‌آ و آپی‌ژنین
مهار می‌گردد.
بحث: انتظار می‌رود
فلاونوئیدها تأثیرات بازدارنده‌ای در
عواقب بیماری دیابت داشته باشند و مصرف آنها می‌تواند از بروز بسیاری از مشکلات
در افراد دیابتی پیشگیری نماید.
کلیدواژه‌ها: فلاونوئید، گلیکوزیلاسیون
پروتئین، آنتی اکسیدان، آلبومین، انسولین، هموگلوبین، بیوچانین‌آ.
*
Ph.D فارماکوگنوزی ،
دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، مرکز تحقیقات قلب و عروق اصفهان.
** Ph.D بیوشیمی بالینی ، دانشگاه علوم پزشکی
اصفهان، مرکز تحقیقات قلب و عروق اصفهان.
*** M.Sc
بیوشیمی بالینی ، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، مرکز تحقیقات قلب و عروق اصفهان.
*
عهده‌دار مکاتبات: اصفهان، میدان جمهوری اسلامی، خیابان خرم، مرکز درمانی تحقیقاتی
صدیقه طاهره(س)، صندوق پستی: 1148-81465
مقدمه:
دیابت ملیتوس
یکی از شایع‌ترین بیماری‌های غدد درون‌ریز و یکی از عوامل چهارگانه مرگ در ایالات
متحده با شیوع 3 تا 10% می‌باشد(1). درصد بالای مرگ و میر در افراد دیابتی بر اثر
عوارض میکرو و ماکروواسکولار می‌باشد که منجر به نارسایی کلیه، چشم، دستگاه قلب و
عروق وسیستم عصبی مرکزی می‌گردد (2و3). شواهد به‌دست آمده از آزمایش‌های بالینی و
مطالعه مدل حیوانی نشان داده‌اند که هیپرگلیسمیای دیابتی اصلی‌ترین عاملی است که در مشکلات پیش‌رونده و
ثانویة دیابت شرکت دارد
(3و4). گلیکوزیلاسیون غیرآنزیمی پروتئین‌های بدن از جمله هموگلوبین که ناشی از
هیپرگلیسمیای طولانی می‌باشد، یکی از علل اصلی مکانیسم‌های پاتوفیزیولوژیک دیابت
می‌باشد(6-2). گلیکوزیلاسیون سبب تغییر در ساختار و عملکرد شماری از پروتئین‌ها از
جمله لیپوپروتئین‌های موجود در غشاء، پروتئین‌های غشای اریتروسیت‌ها، پلاکت‌ها،
پروتئین‌آلفا کریستالین عدسی چشم و نیز پروتئین‌های سرمی انسان مثل آلبومین،
هموگلوبین، کلاژن، میلین و انسولین می‌گردد(15-5). انتظار می‌رود آنتی‌اکسیدان‌ها،
گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها را با یک مکانیسم بازدارنده مهار نمایند. تاکنون بیش از
4000 نوع مادة بی‌نظیر آنتی‌اکسیدان از اندام‌های گیاهی از جمله میوه‌ها، سبزیجات،
مغزها، دانه‌ها، ریشه‌ها و گل‌ها و نیز از چای و شراب جدا شده‌اند
(16). فلاونوئیدها که دارای خواص آنتی‌اکسیدانی می‌باشند، به طور وسیعی در
سبزیجات و سایرگیاهان وجود دارند. مطالعات زیادی درخصوص ظرفیت این دسته از مواد در
به‌دام انداختن رادیکال هیدروکسیل و پروکسیل انجام شده است(17و18). فلاونوئیدها یک
دسته مهم از ترکیبات گیاهی می‌باشند که دارای فعالیت‌های بیوشیمیایی مختلف و نیز
از ترکیبات مهم آنتی‌اکسیدان می‌باشند. از آنجا که فلاونوئیدها از نظر ساختمان
شیمیایی دارای دستجات مختلف می‌باشند و با توجه به ارتباط ساختمان شیمیایی
فلاونوئیدها با طرز عمل آنها، در این تحقیق سعی شده است از فلاونوئیدهای مختلف
استفاده گردد. تأثیرات بازدارنده روتین1، کوئرستین2 و
کامفرول3 در گلیکوزیلاسیون هموگلوبین تحت شرایط in
vitro نشان داده شده‌است(19). هدف این مطالعه اندازه‌گیری تأثیرات مهاری
هفت نوع فلاونوئید خالص شامل روتین،کوئرستین، کامفرول، مورین4، آپی‌ژنین5،
نارینجین6 و بیوچانین‌آ7 درگلیکوزیلاسیون آلبومین، هموگلوبین و انسولین
تحت شرایط in vitro می‌باشد.
مواد و روش‌ها:
برای بررسی
اثرات مهاری هفت‌نوع فلاونوئید خالص شامل روتین، کوئرستین، کامفرول، مورین، آپی
ژنین، نارینجین و بیوچانین آ بر گیلکوزیلاسیون آلبومین، هموگلوبین و انسولین تحت
شرایط invitro،
ابتدا محلولهای پروتئینی تهیه گردیدند و میزان گیلکوزیلاسیون آنها در حضور
غلظت‌های مختلف و
1. Rutin 2.
Quercitin 3. Kaempferol 4. Morin
5. Apigenin 6.
Naringin 7. Biochanin A
نیز زمان‌های
مختلف مورد بررسی قرار گرفت و بعد از به‌دست آمدن شرایط بهینه جهت گیلکوزیلاسیون
هر پروتئین، تأثیر هریک از فلاونوئیدها (در غلظت‌های مختلف) به‌طور جداگانه تعیین
گشت که مراحل انجام آن به شرح زیر است:
1-تهیه محلولهای
پروتئینی:
روش تهیه
هموگلوبین مشابه گزارش قبلی ما می‌باشد. خون از افراد داوطلب نرمال تهیه و از EDTA
به‌عنوان ماده ضدانعقاد استفاده‌شد (19).
سلول‌های‌گلبول قرمز سه‌بار با محلول NaCl M14/0 شسته شد و
سپس 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون گلبول‌های قرمز لیزشده با 2 میلی لیتر از بافر فسفات M
01/0 با 4/7 =pH و نیز 5/0 میلی لیتر
4 CCl
مخلوط گردید. سپس قسمت لیزشده با استفاده از سانتریفوژ جدا گشت. لایة فوقانی جدا
و غلظت هموگلوبین با روش Drabkin تعیین گردید
(20و21).
آلبومین
انسانی (g5 sigma)
با 100 میلی‌لیتر بافر فسفات M01/0 با 4/7 = pH رقیق گردید. همچنین انسولین گاوی نرمال (ml/Iu
100) از کارخانه Lilly تهیه‌گردید. سپس باافزودن 5/0میلی‌لیتر از
بافرفسفات M01/0 با 4/7 pH=
به صورت محلول آماده گشت.
2-تعیین شرایط
بهینه برای گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها:
محلول گلوکز در
غلظت‌های0، 4، 10، 20، 30، 40 و 50 ml/mg
در بافر فسفات M01/0 با 4/7=pH
حاوی جنتامایسین (ml/100/mg20) تهیه‌گردید.
غلظت بهینه گلوکز و زمان انکوباسیون به طور
جداگانه برای هر پروتئین تهیه‌شد. محلولهای پروتئینی به مدت 24، 72،
48 و 96 ساعت انکوبه‌شدند. پس از انکوباسیون با 1 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک اسید20%
دو بار شستشو و به کمک سانتریفوژ در دور rpm
3000 به مدت 10 دقیقه جدا شدند. ته‌نشین به‌دست‌آمده در °C100
به مدت یک‌ساعت در حمام آب گرم با یک میلی‌لیتر از بافر فسفاتM01/0
با 4/7 =pH و نیز 5/0 میلی‌لیتر از اسیداگزالیک N
3/0 قرارگرفت. سپس در حرارت اطاق (°C25) با 5/0 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک اسید
40% توسط سانتریفوژ در دور rpm 3000 به مدت
10 دقیقه مجدداً رسوبات جدا گردید. محلول رویی جدا شد و سپس در °C40 به مدت 30 دقیقه با 5/0 میلی‌لیتر از
تیوباربیتوریک‌اسید M05/0 مخلوط‌گردید.
محصول نهایی در nm443 با روش کالریمتری اندازه‌گیری گردید(22).
3-تهیه محلولهای
فلاونوئید:
محلولهای استوک
(ml/mg1) فلاونوئیدهای روتین، کوئرستین و کامفرول
از کارخانه مرک، مورین، نارینجین و آپی‌ژنین از کارخانه سیگما و بیوچانین‌آ از
آلدریچ تهیه شدند. سپس در اتانول حل و آنگاه غلظت‌های10، 100 و 200 ml/µg
از هرفلاونوئید به صورت جداگانه در دی‌متیل‌سولفوکساید آماده شدند.
4- روش اندازه‌گیری:
1 میلی لیتر
آلبومین (ml/mg 50) ، 1 میلی‌لیتر
هموگلوبین (ml/mg50)و 5/0 میلی‌لیتر
از انسولین نرمال (ml/Iu
100) با 5/0 میلی‌لیتر از بافر فسفات M01/0 با 4/7 =pH
به مدت 72 ساعت به صورت جداگانه در حضورغلظت‌های مختلف فلاونوئیدها و 1 میلی‌لیتر
از محلول حاوی گلوکز(برای انسولین و‌آلبومین ml/mg30
و برای هموگلوبینml/mg20) حاوی
جنتامایسین ml100/mg20 در بافر
فسفات M01/0 با4/7 = pH انکوبه
گردیدند. همچنین در گروه کنترل که حاوی همة مواد بجز فلاونوئیدها بودند، آزمایش‌ها
تکرار گردید. سپس درجه گلیکوزیلاسیون در حضور محصولات مختلف و نیز در فقدان آنها
با اسپکتروفتومتر‌اندازه‌گیری شد(20و22).
یافته‌ها:
زمان انکوباسیون
و غلظت بهینه گلوکز برای هریک از محلولهای پروتئینی در نمودارهای 1تا 3 نشان داده
شده است. درصد مهار گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها به‌عنوان معیاری از اثر
فلاونوئیدهای تحت آزمایش مورداستفاده قرارگرفت(جدول 1). برای هرغلظت از پروتئین‌های
تحت بررسی ، 3 بار هر آزمایش تکرار‌گردید و اعداد گزارش‌شده به‌صورت میانگین سه
بار آزمایش بیان‌شده‌اند. آزمون T تفاوت آماری
مهمی را بین نمونه‌های آزمایش و کنترل در تمام موارد تحت آزمایش نشان داد (05/0P<).
مقایسه بین توان مهارکنندگی هر یک از فلاونوئیدها (در غلظت حداکثر) برای
گلیکوزیلاسیون غیرآنزیمی پروتئین‌ها به صورت ذیل بیان شده است:
1- روتین و
کامفرول حداکثر قدرت‌مهارکنندگی را در
گلیکوزیلاسیون انسولین داشته‌اند. ترتیب مهارکنندگی این دو فلاونوئید بر
پروتئین‌های تحت آزمایش به شرح ذیل است:
هموگلوبین>آلبومین> انسولین.
2- کوئرسیتن
دارای حداکثر اثر مهاری 85% بر گلیکوزیلاسیون آلبومین است. آپی‌ژنین حداکثر قدرت
مهارکنندگی را بر گلیکوزیلاسیون آلبومین
(100%) دارد. نارینجین گلیکوزیلاسیون آلبومین را به میزان 97% مهار می‌کند. مورین
گلیکوزیلاسیون آلبومین را به میزان 90% مهار می‌کند.
بیوچانین‌آ نیز حداکثر اثر مهاری را بر گلیکوزیلاسیون آلبومین و انسولین به
میزان 100% دارد. ترتیب مهارکنندگی این فلاونوئیدها بر پروتئین‌های موردآزمایش به
شرح ذیل است:
هموگلوبین > انسولین >
آلبومین
جدول 1- درصد
مهار گیلکوزیلاسیون هموگلوبین، آلبومین و انسولین توسط فلانوئیدهای خالص.
|
پارامتر
|
هموگلوبین
|
آلبومین
|
انسولین
|
|
غلظت*
ترکیبات
|
5/0
|
5
|
10
|
5/0
|
5
|
10
|
5/0
|
5
|
10
|
|
|
-
|
-
|
-
|
83
|
83
|
93
|
62
|
83
|
93
|
|
|
-
|
-
|
-
|
55
|
65
|
85
|
45
|
67
|
79
|
|
|
-
|
-
|
-
|
60
|
70
|
78
|
62
|
81
|
93
|
|
|
42
|
50
|
49
|
72
|
78
|
90
|
67
|
77
|
82
|
|
|
29
|
60
|
64
|
82
|
99
|
100
|
42
|
47
|
61
|
|
|
39
|
46
|
59
|
72
|
79
|
97
|
64
|
72
|
72
|
|
|
47
|
35
|
66
|
73
|
97
|
100
|
70
|
96
|
100
|
* غلظت بر حسب(ml/µg)
بحث:
به رغم انسولین
درمانی، در بیماران دیابتی مشکلات بالینی خاصی براثرگلوکز‌بالای‌خون وجود دارد‌که
منجر به گلیکوزیلاسیون غیرآنزیمی در پروتئین‌های عدسی چشم، پروتئین‌های غشای
سلولی، آلبومین، کلاژن هموگلوبین و میلین می‌گردد. در مطالعه Kampen
تأثیرات بازدارنده فلاونوئیدهای مختلف
(ml/µg 5/0، 5و 10) در گلیکوزیلاسیون هموگلوبین
گزارش شده است. روتین به‌میزان 11، 27 و 42درصد، کوئرستین 3، 37و 52 درصد و کامرول
به‌میزان 10، 12 و 15 درصد گلیکوزیلاسیون هموگلوبین را مهار می نماید(19). در این
مطالعه آثار آنتی‌اکسیدانی فلاونوئیدها و نیز قدرت مهاری آنها بر گلیکوزیلاسیون
اکسیداتیو بررسی شده است.قدرت مهاری به صورت وابسته به غلظت در تمام حالات افزایش
می‌یابد. تغییرات گسترده‌ای که در تأثیرات مهاری در گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها
مشاهده می‌شود، احتمالاً ناشی از شرکت بخش‌های مختلفی از گروه‌های عملکردی در
واکنش‌های ملکول پروتئین می‌باشد. غالباً ساختار‌مولکولی، این تفاوت‌ها را توجیه
می‌کند؛ به‌طور مثال روتین در غلظتml/µg5/0
حداقل اثر مهاری را بر آلبومین نشان داده است(6%)، در صورتی‌که بر دو پروتئین دیگر
اثر قابل‌ملاحظه‌ای داشته است. این اثر ممکن است به‌طور جزئی بر اثر تفاوت در گونه‌ها
و سایت‌های گروه‌های عملکردی و نیز میزان فعالیت خود ملکول پروتئین باشد. به طور
عمومی ساختار یک ملکول پروتئینی می‌تواند این‌تفاوت‌ها را توجیه کند. این‌حقیقت‌که
گلیکوزیلاسیون آلبومین به‌وسیله آپی‌ژنین (ml/µg10)
100% مهار می‌گردد، می‌تواند نقش احتمالی تأثیر ساختار خواص شیمیایی پروتئین را در
چگونگی مهار گلیکوزیلاسیون آن تقویت نماید. از طرف دیگر، خواص ساختاری و شیمیایی
فلاونوئیدها می‌تواند خود به‌تنهایی بیانگر این تغییرات باشد(23). نکنه جالب توجه
اینکه بیوچانین‌آ (ml/µg10)
که دارای‌حداکثر اثر مهاری بر هرسه نوع پروتئین است، یک ایزوفلاون می‌باشد،
درحالی‌که آپی‌ژنین که تنها دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی قابل‌توجهی
برگلیکوزیلاسیون آلبومین است، یک فلاون می‌باشد. به نظر می‌رسد ایزوفلاون‌بودن
مولکول فلاونوئید موجب افزایش خاصیت احیاکنندگی یا الکترون‌دهندگی مولکول می‌گردد
و خاصیت آنتی‌اکسیدانی آن را در مقایسه با سایر فلاونوئیدها در مهار گلیکوزیلاسیون
پروتئین‌ها افزایش می‌دهد. از طرفی ساختمان مولکولی آپی‌ژنین(از دسته فلاون‌ها)
خاصیت الکترون‌دهندگی مولکول را در مقایسه با سایر فلاونوئیدها جهت مهار واکنش
گلیکوزیلاسیون آلبومین در ردیف بیوچانین قرار می‌دهد. در این مورد نقش ساختمان
مولکول آلبومین (در مقایسه با ساختمان مولکول انسولین و هموگلوبین) نیز در بروز
اثر مهاری آپی‌ژنین قطعاً مؤثر بوده است. یافته‌های مطالعه موجود نشان داده‌اندکه
فلاونوئیدها، گلیکوزیلاسیون آلبومین، هموگلوبین و انسولین را در شرایط in
vitro مهار می‌کنند. پیشنهاد می‌شود
که این آزمایش‌ها بر مدل‌های حیوانی و انسانی انجام گیرد و با اطمینان‌یافتن از
تأثیر فلاونوئیدها بر مهار گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها در انسان از آنها به منظور
پیشگیری و کنترل عواقب ناشی از گلیکوزیلاسیون پروتئین‌ها که در تمامی سلول‌های بدن
و حتی در سطح رسپتور انجام می‌شود، استفاده نمود. مطالعات نشان داده است که استرس‌های
اکسیداتیو و نیز محصولات نهایی گلیکوزیلاسیون عامل اصلی در
پاتوژنز
آترواسکلروز، پیری و بسیاری از بیماری‌ها می‌باشد و نیز مطالعات‌اخیر نشان‌داده‌است
درصورتی که از مواد cross-link breaker از قبیل ALT-711
استفاده‌شود، موجب بهبودی در وضعیت سیستم قلبی، عروقی و نیز کلیوی در رت‌ها خواهد
شد(24 و 25).
References:
1. Vlassara H| Brownlee M| Cerami A.
Non-enzymatic glycosylation of peripheral nerve protein in diabetes mellitus.
Proc Natl Acad Sci USA 1981 Aug; 78(8):5190-2.
2. Chase HP| Jackson WE| Hoops SL|
Cockerham RS| Archer PG| OBrein D. Glucose control and the renal and retinal
complications of insulin-dependent diabetes. JAMA 1989 Feb 24; 261(8): 1155-60.
3. The diabetes control and
complications trial research group. The effect of intensive diabetes therapy on
the development and progression of neuropathy. Am Intern Med 1995; 122:501-8.
4. Fox CJ| et al. Studies of unusual
hemoglobin in patients with diabetes mellitus. Br Med J 1997; 2:605-7.
5. Friedman E| Rodby R| Cerami A|
Bucala R. Hemoglobin-AGE: a circulating marker of advanced glycosylation.
Science 1992 Oct 23; 258 (5082):651-3.
6. Bucala R| Cerami A. Advanced
glycosylation: chemistry biology and implications for diabetes and aging. Adv
Pharmacol 1992; 23:1-34.
7. Bunn HF. Evaluation of glycosylated
hemoglobin in diabetic proteins. Diabetes 1981 Jul; 30(7): 613-7.
8. Nathan DM| Singer DE| Hurxthal K|
Goodson JD. The clinical information value of glycosylated hemoglobin assay. N
Engl J Med 1984 Feb 9; 310:341-346.
9. Bucala R| Makita Z| Koschinsky T|
Cerami A| Valssara H. Lipid advanced glycosylation: Pathway for lipid oxidation
in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 1993 Jul
15; 90 (14): 6434-8.
10.
Watala C| Witas H| Olszowska L| Piasecki W. The association between
erythrocyte internal viscosity| protein non-enzymatic glycosylation and
erythrocyte membrane dynamic properties in juvenile diabetes mellitus. Int J
Exp Pathol 1992 Oct; 73(5): 655-63.
11.
Bailey AJ| Robins SP| Tanner MJ. Reducible components in the
proteins of human erythrocyte membrane. Biochim Biophys Acta 1976 May 20 ;
434(1):51-7.
12.
Wolff SP. Diabetes mellitus and free radicals. Free radicals|
transition metals and oxidative stress in the aetiology of diabetes mellitus
and complications. Br Med Bull 1993 Jul; 49:645-652.
13.
Liang JN| Chylack LT Jr. Change in the protein tertiary structure
with non-enzymatic glycosylation of calf alpha-crystallin. Biochem Biophys Res
Commun 1984 Sep 28; 123(3): 899-906.
14.
Defronzo RA. Current therapy of diabetes mellitus. Philadelphia:
Mosby| Inc; 1998| P.51-52.
15.
Kohn RR| Cerami A| Monnier VM. Collagen aging in vitro by
non-enzymatic glycosylation and browning. Diabetes 1984; 33:57-59.
16.
Middlton E| Kandaswami C. The impact of plant flavonoids on
mammalian biology: implications for immunity| inflammation and cancer: In:
Harborne JB| editor. The flavonoid advances research science 1986. London:
Chapman & Hall; 1994| P.619-652.
17.
Afanas’ev IB| Dorozhko AI| Brodskii AV| Kostyuk VA| Potapovitch AI.
Chelating and free radical scavenging mechanisms of inhibitory action of rutin
and quercetin in lipid peroxidation. Biochem Pharmacol 1989; 38 (11):1763-9.
18.
Samuelsson G. Drugs of natural origin. 4th ed. Stockholm: Swedish
Pharmaceutical Press; 1999| P.226-227.
19.
Asgary S| Naderi GH| Sarraf-Zadegan N| Ghassemi N| Boshtam M| Rafie
M| et al. Anti-oxidant effect of flavonoids on hemoglobin glycosylation. Pharm
Acta Helv 1999 Feb; 73 (5): 223-226.
20.
Burtis HF| Ashwood ER. Measurement of hemoglobin concentration in
whole blood clinical chemistry: In: Burtis CA| A showed ER| editors. Tirtz text
book of clinical chemistry 2nd ed.
Philadelphia: WB Saunders Co; 1994| P. 2020-2030.
21.
Van Kampen EJ| Zijlstra WG. Determination of hemoglobin and its
derivatives. Adv Clin Chem 1965; 8:141-187.
22.
Fluckiger R| Winter halter KH. Biochemical and clinical aspects of
hemoglobin abnormalities. Academic press| New York: Academic Press; 1978|
P.208.
23.
Mora A| Paya M| Rios JL| Alcaraz MJ. Structure-activity
relationships of polymethoxyflavones and other flavonoids as inhibitors of
non-enzymic lipid peroxidation. Biochem Pharmacol 1990 Aug 15; 40(4): 793-7.
24.
Raj DS| Lim G| Levi M| Qualls C| Jain SK. Advanced glycation end
products and oxidative stress are increased in chronic allograft nephropathy.
Am J Kidney Dis 2004 Jan; 43(1):154-60.
25.
Susic D| Varagic J| Ahn J| Frohlich ED. Cardiovascular and renal
effects of a collagen cross-link breaker (ALT-711) in adult aged spontaneously
hypertensive rats. Am J Hypertens 2004 Apr; 17(4): 328-33.