اثر تجویز مکرر سیانید به رت برمقاومت قلب مجزا شده حیوان

 در برابر ایسکمی

دکتر داریوش شکیبایی *؛ دکتر مهدی نعلینی**؛ دکتر علی‌اکبر نجاتی صفا***

چکیده :

سابقه و هدف : با توجه به اینکه بیماری‌های ایسکمی قلبی یکی از شایع‌ترین عوامل مرگ و میر در دنیای امروز به‌شمار می‌روند ، شناسایی روش‌هایی که قلب را در برابر ایسکمی محافظت می‌کنند، بسیار با اهمیت است. مکانیسم های تطابقی متعددی در این خصوص شناسایی شده که بعضاً توسط مهار متابولیک در سطح سلولی القا گردیده اند. با توجه به اینکه سیانید یک مهارکننده متابولیک قوی است و موجب مهار آنزیم سیتوکروم اکسیداز و تنفس‌سلولی می‌گردد، هدف مطالعه حاضر بررسی این نکته است که به‌کارگیری سیانید تا چه میزان درافزایش مقاومت قلب نسبت به ایسکمی مؤثر می‌باشد؟

موادو روش‌ها : مطالعه حاضر به روش تجربی روی رت‌های نر بالغ دردو گروه تست و کنترل صورت گرفت. درگروه تست حیوانات روزانه  mg/kg  7/1سیانید پتاسیم را از طریق داخل صفاقی به مدت 35 روز متوالی دریافت داشتند. درگروه کنترل به همان میزان سالین نرمال تجویز گردید. سپس قلب کلیه حیوانات طبق روش لانگندورف  مجزاشدند و هریک سه مرحله کنترل اولیه ، دوره ایسکمی ( با کاهش پرفیوژن به 40% میزان اولیه ) و بازگشت به پرفیوژن آزاد را گذراندند.  برای بررسی آماری از آزمون t  جفت‌نشده استفاده شد.

یافته‌ها: نتایج نشان داد که میزان جریان مایع کرونر ، فشار بطن چپ LVP و قابلیت انقباضی dp/dt درمرحله اول و همچنین وزن قلب‌ها در دو گروه تفاوت معناداری نداشتند، اما درمرحله ایسکمی درصد تغییرات LVP و dp/dt نسبت به حالت اولیه درگروه‌تست (88/2 ± 8/31 – و53/2 ± 32/44 -) نسبت به‌گروه‌کنترل(19/5 ± 29/55 –و73/4 ± 48/60 - ) به طور معناداری تفاوت داشتند(005/0P<  ). در مرحله سوم نیز درصد تغییرات درگروه تست (59/4± 49/11 و
24/4 ± 28/10) به طور معناداری با گروه کنترل (62/7 ± 12/8 – و13/7 ± 19/9 -) متفاوت بود(05/0 P<) .

بحث : این نتایج حاکی از حفظ مناسب تر عملکرد قلب درطول دوره ایسکمی و بازگشت پرفیوژن آزاد در گروه تست نسبت به گروه کنترل می باشد که احتمالاً از طریق تأثیر سیانید در مهار متابولیک و تحریک مکانیسم‌های مقاوم‌سازی داخل سلولی‌صورت‌گرفته است . درمجموع به نظرمی‌رسدکه سیانید عامل مناسبی برای القای مقاوم سازی قلبی نسبت‌به ایسکمی‌بوده‌است. مطالعات‌تکمیلی‌به‌منظور‌روشن‌شدن‌مکانسیم‌های دقیق‌سلولی ومولکولی‌دراین‌خصوص‌پیشنهادمی‌گردد.

کلیدواژه‌ها : سیانید، ایسکمی، قلب مجزا شده ، فشار بطن چپ ، حفاظت قلبی .

_**پزشک مرکز تحقیقات قلب و عروق دانشگاه علوم پزشکی کرمانشاه                _*** پزشک عمومی.

_* عهده دار مکاتبات: کرمانشاه، باغ ابریشم ، دانشکده پزشکی، مرکز تحقیقات پزشکی مولکولی، آزمایشگاه تحقیقاتی فیزیولوژی قلب .

Email: d-shackebaei@yahoo.com

مقدمه :

بیماری‌های ایسکمی قلب یکی از شایع‌ترین عوامل مرگ و میر و ایجاد ناتوانی در دنیای امروزبه شمار می‌روند (1و2). با توجه به اینکه قلب عضوی حساس به هیپوکسی است(3). شناسایی روش‌هایی که آن را در برابر هیپوکسی محافظت می‌کند ، بسیار با اهمیت است. از جمله این روش‌ها تطابق است . درخصوص تطابق بیولوژیک نسبت به هیپوکسی ناشی از ارتفاعات زیاد، مطالعات متعددی صورت گرفته است . از جمله نشان داده شده که تحت چنین شرایطی ظرفیت بستر عروق کرونرتا دو برابر افزایش  و توانایی و راندمان سیستم تأمین انرژی قلبی نیز افزایش می‌یابد . در واقع چنین قلبی 40-30 درصد کمتر از حدعادی اکسیژن مصرف می‌کند، اما فعالیت نرمال دارد . با توجه به این نکات استفاده از این روندهای‌تطابقی در پیشگیری از بیماری‌هایی همچون ایسکمی قلبی پیشنهادشده است(4). یکی ازمهم‌ترین روندهای سازگاری قلبی ، مکانیسمی‌موسوم‌بهIPC) Preconditioning Ischemic )می‌باشد(5). دراین پدیده دوره‌های کوتاه‌مدت و تکراری ایسکمی موجب حفاظت موقت قلبی در برابر ضایعات ناشی از دوره‌های طولانی ایسکمی بعدی می‌گردد و درمجموع مقاومت قلب را نسبت به ایسکمی‌های طولانی‌مدت بعدی افزایش می‌دهد(8-5).  همچنین درمطالعه روی قلب رت‌ها مشاهده شده که اثرهای محافظتی متابولیک و انقباضی مشابه آنچه در IPC رخ می‌دهد، با استفاده از مهار متابولیک حاصله از دوره‌های کوتاه‌مدت مواجهه با سیانید به‌وجود آمده است(5). با توجه به اینکه ترکیبات سیانید با آهن موجود در هم سیتوکروم‌های سلولی واکنش می‌دهد و با مهار تنفس سلولی منجر به نوعی هیپوکسی سلولی می گردد(12-9)، آیا می‌توان با استفاده از این مهارکننده متابولیک تاثیرات محافظتی ذکرشده را در کاردیومیوسیت‌ها القا نمود؟ در واقع هدف‌مطالعه حاضر بررسی این احتمال است که به‌کار گیری ظرفیت‌های تطابقی کاردیومیوسیتها با استفاده از سیانید تا چه میزان در افزایش مقاومت قلب نسبت به ایسکمی مؤثر می باشد؟

مواد و روش‌ها:

دراین مطالعه که به روش تجربی و با رعایت استانداردهای کار با حیوانات صورت گرفت ، از رت‌های نر بالغ نژادN- MARI  با وزن 300 – 250 گرم استفاده شدکه به صورت تصادفی به دو گروه تست و کنترل تقسیم شدند. حیوانات گروه تست
(32=n) روزانه به میزان mg/kg  7/1سیانید پتاسیم از طریق داخل صفاقی به مدت 35 روز متوالی دریافت داشتند ( این دوز دریک مطالعه راهنما به‌دست آمده بود و معادل 17% مقدار LD50 سیانید در رت  می‌باشد)(13). درگروه کنترل با توجه به سایر مطالعات مشابه تعداد 10حیوان تحت تزریق داخل صفاقی سالین نرمال با حجم و مدت زمان مساوی قرار گرفتند . پس از طی دوره مذکور بلافاصله هریک از حیوانات ابتدا با اتر و اکسیژن بیهوش‌شده و سپس قفسه سینه آن‌ها باز می‌شد. قلب به سرعت خارج می‌شد و به درون محلول لاک صفر تا چهار درجه سانتی‌گراد وارد می‌گشت . قلب که دراین مرحله از ضربان باز می‌ایستاد ، به سرعت از طریق آئورت و مطابق روش لانگندورف تحت پرفیوژن با محلول لاک قرار می‌گرفت(محتویات محلول لاک برحسب گرم درصدمیلی لیتر: 9/0 NaCl ،
 42 0/0KCl، 24 0/0CaCl2، 015/0 NaHC03، 1/0  Glucose ). pH محلول در حد 45/7 –35/7 ، حرارت آن 37 درجه سانتی‌گراد و فشار آن در حدود 60میلی‌متر جیوه تنظیم می‌گردید. دراین مرحله جهت اندازه‌گیری‌فشاربطن‌چپ(Left Ventricular Pressure =(L.V.P یک بالن کوچک به حجم حدوداً 05/0 میلی‌لیتر از طریق دهلیز چپ به بطن چپ وارد می‌شد. این بالن از طریق یک Pressure Transducer  به کوپلر Strain gauge  و از این طریق به فیزیوگراف متصل بود. علاوه بر آن با استفاده از فشار بطن چپ و به وسیله یک Differentiator coupler  میزان قابلیت انقباضی بطن چپ(dp/dt)  نیز سنجش می‌شد.

همچنین الکترودهای ظریفی بر سطح قلب قرار داده‌می‌شدکه از طریق Hi – gain coupler  متصل‌شده به فیزیوگراف ، الکتروکاردیوگرام را ثبت نماید. به‌منظور اندازه‌گیری میزان جریان مایع   کرونر(coronary  solution  Flow =C.S.F.) نیز از یکDrop counterکه درسطح‌زیرین‌قلب‌قرارمی‌گرفت و از طرف دیگر به فیزیوگراف اتصال داشت، استفاده می‌گردید.

پروتکل آزمایش به این ترتیب بودکه هریک از قلب‌هاپس از مجزاشدن سه مرحله ذیل را             می گذراندند: مرحله اول که در آن عملکرد طبیعی قلب تحت پرفیوژن آزاد مایع به   مدت 20-15 دقیقه ثبت می شد (14) (مرحله کنترل). مرحله دوم که درآن میزان پرفیوژن مایع به 40 % مقدار اولیه کاهش داده می‌شد و قلب را به مدت 30 دقیقه درشرایط ایسکمی قرار می‌داد (مرحله ایسکمی) ( 16-15)  و مرحله سوم که مجدداً پرفیوژن آزاد مایع برقرار می‌شد و عملکرد قلبی به‌مدت 30 دقیقه ثبت می‌گردید (مرحله بازگشت پرفیوژن). (15،14و17). پارامترهای مختلف قلبی درکلیه این مراحل ثبت می‌شد. میزان تغییرات هریک از پارامترها در هر نمونه ، مشخص و سپس میانگین آن‌ها در دو گروه تست و کنترل با یکدیگر مورد مقایسه و بررسی قرار گرفتند. علاوه بر پارامترهای مختلف قلبی ، میانگین وزن قلب حیوانات و میانگین نسبت وزن قلب به وزن بدن در دو گروه نیز مشخص شد و موردبررسی قرار گرفت. برای مقایسه نتایج از آزمون Tزوج‌نشده استفاده شد.

یافته‌ها:

مقادیر متوسط وزن حیوانات دردو گروه تست و کنترل ( 8/5  ± 286 گرم و 5/8 ± 288 گرم ) ، وزن قلب (29 0/0± 32/1 گرم و 57 0/0 ± 28/1 گرم ) و نسبت وزن قلب به وزن بدن در دو گروه تفاوت معناداری با یکدیگر نداشتند.

نمونه‌ای از پارامترهای مختلف قلبی ثبت شده در دو گروه تست و کنترل درشکل1 و مقادیر پارامترهای مختلف قلبی نیز در ضمن مراحل سه گانه آزمایش در دو گروه ، در جدول 1 نشان داده شده است .

درمرحله اول ، میانگین تعداد ضربانات قلبی درگروه تست به طور معناداری بیش از گروه کنترل بود
(05/0 P<)، درصورتی که در سایر پارامترها تفاوت

جدول1- میانگین مقادیر پارامترهای مختلف قلبی درمراحل سه‌گانه مطالعه دردو گروه تست و کنترل.

P<001  ***            ** P<0.005                     *P<0.05.001

                  گــــروه تســــت                                    گــــروه کنتــــرل

ECG

CSF

LVP

Dp/dt

   مرحله بازگشت        مرحله ایسکمی       مرحله کنترل                مرحله بازگشت         مرحله ایسکمی           مرحله کنترل

 پرفیوژن                                                       پرفیوژن

شکل 1-  ثبت پارامترهای مختلف قلبی دریک نمونه از قلبهای مجزا شده در گروه تست و کنترل.

معناداری مشاهده نگردید. درمرحله دوم ، میانگین پارامترهای قلبی فشار بطن چپ (LVP)   و قابلیت انقباضی آن(dp/dt) به طور معناداری درگروه تست بیشتر از گروه کنترل بود (001/0 P<).

جدول 2 – میانگین درصد تغییرات پارامترهای مختلف قلبی درمرحله دوم نسبت به مرحله اول درگروه‌های تست و کنترل.

جدول 3 - میانگین درصد تغییرات پارامترهای مختلف قلبی درمرحله سوم نسبت به مرحله اول درگروه‌های تست و کنترل.

درمرحله سوم نیز میانگین پارامترهای LVP و dp/dt درگروه تست به طور معناداری بیش از گروه کنترل بود( 5 00/0 P  < ).

از طرف دیگر تغییرات پارامترهای مختلف قلبی در ضمن ایسکمی نسبت به مرحله اول نشان داد
که درصد افت تعداد ضربانات قلبی به طور متوسط درگروه تست به طور معناداری بیش از گروه
کنترل(33/2± 3/35 – دربرابر 48 /5±07/24 –بک
05/0P<) ومیانگین درصد افت LVP  وdp/dt  درگروه‌تست(88/2 ± 80/31 – و53/2 ± 32/44 -) به‌طور معناداری کمتر از گروه کنترل
(19/5 ±29/55- و73/4 ± 48/60– با005/0 P< )بود (جدول2 ).

درصد تغییرات پارامترهای قلبی درمرحله سوم نسبت به مرحله اول درجدول 3 مشاهده می‌گردد.

درصد افت تعداد ضربانات قلبی درگروه تست به‌طورمعناداری‌بیش‌از گروه کنترل (20/2 ± 17/11 – دربرابر06/8 ± 13/5 با 01/0 P< )بود و درحالی که تغییرات میزان جریان مایع کرونر در دو گروه معنادار نبود، درصد افت پارامترهای LVP وdp/dt درگروه کنترل ( 62/7 ± 12/8 – و13/7  ±  19/9 -) به‌طور معناداری بیش از گروه تست ( 59/ 4  ±49/11 و
24 / 4 ±   28/10 ) بود (05/0 P < ).

بحث:

نتایج این مطالعه نشان داد که پارامترهای قلبی فشار بطن چپ و قابلیت انقباضی آن با وجودی که در ابتدای آزمایش در دو گروه با یکدیگر تفاوت قابل‌ملاحظه‌ای نداشتند، اما در دوره ایسکمی و بازگشت‌پرفیوژن‌متعاقب آن ، این پارامترها که معرف عملکرد انقباضی قلب‌می‌باشند، در گروه تست به‌طور معناداری در وضعیت بهتری نسبت به گروه کنترل قرار داشتند. به‌عبارت دیگر گروهی که مقادیر اندکی سیانید مطابق پروتکل مذکور دریافت نموده‌اند، وضعیت مناسب‌تری از نظر حفظ فشار بطن چپ و قابلیت انقباضی آن در دوره ایسکمی و پرفیوژن متعاقب آن از خود نشان داده‌اند. این یافته‌ها بیانگر پاسخ بهتر قلبی دراین شرایط و احتمالاً وقوع درجاتی از سازگاری درقلب‌های‌گروه دریافت‌کننده سیانید می‌باشد. این نکته درسایر مطالعات نیز نشان داده شده که اگر چه قلب به عنوان یک عضو فعال متابولیک ، به حملات حاد هیپوکسی بسیار حساس است ، اما با ایجاد تطابق می‌تواند دوره‌های طولانی کمبود اکسیژن را تحمل‌کند(3). همچنین این واقعیت مشخص شده است که قلب تطابق‌یافته می‌تواند با حفظ‌سطح برون‌ده ، اکسیژن کمتری را مصرف نماید. به‌عبارت دیگر در طی تطابق بهره‌برداری از اکسیژن برای عملکرد انقباضی مؤثرتر می‌گردد(4).

ازجمله مکانیسم‌های پیشنهادی دراین خصوص که توسط Chandel و همکاران  ارائه شده بدین ترتیب است که توانایی مهار فعالیت متابولیک و مصرف ATP در ضمن هیپوکسی، می‌تواند منجر به مقاومت بیشترسلول‌ها در برابر فشارهای ناشی از هیپوکسی شدیدتر گردد. این تطابق هیپوکسیک احتمالاً ناشی از مهار نسبی انتقال الکترون در سطح میتوکندری است که به واسطه تأثیرات تنظیم‌کننده اکسیژن مولکولی بر آنزیم‌های کاتالیتیک سیستم انتقال الکترون انجام می‌شود. آنزیم سیتوکروم C اکسیداز که در آخرین مرحله انتقال الکترون میتوکندری عمل می‌کند، بنابرموقعیت ویژه خود می‌تواند محل عمده کنترل اکسیداسیون سلولی طی هیپوکسی باشد(18). باتوجه به اثر مهاری سیانید بر آنزیم مذکور بعضاً این ماده به‌عنوان یک کاندیدای قابل‌قبول برای ایجاد IPC در سایر مطالعات مورد استفاده قرار گرفته است(19،5و20)و درمطالعه حاضر نیز احتمالاً تغییرات عملکردی قلب درگروه تست ناشی از این تأثیرات تطابقی می‌باشد. دریکی از این مطالعات نشان داده‌شده که با استفاده از مهار متابولیک می‌توان تأثیرات حفاظتی ناشی از IPC را که از مکانیسم‌های مهم تطابق به ایسکمی است ، در میوکارد به‌وجود آورد. همچنین  مشخص شده که این تأثیرات بدون نیاز به کاهش جریان کرونر و صرفاً‌با استفاده از مهار متابولیک ناشی از سیانید می‌تواند به وقوع بپیوندد(5). درخصوص تعداد ضربانات قلبی در گروه تست، باتوجه به اینکه  تاکی‌کاردی یکی از عوارض شناخته‌شده قلبی ناشی از تجویز سیانید می‌باشد(21)، به‌نظر می‌رسد که درمطالعه حاضر نیز تعداد بالاتر ضربانات قلبی درگروه تست به همین علت باشد.

 به‌طورکلی درمطالعه‌حاضر، با وجود عدم‌تفاوت معنادار درمیزان جریان مایع کرونر ،  وزن قلب‌ها و پارامترهای‌عملکردی قلب درمرحله ابتدایی آزمایش، حفظ مناسب‌تر عملکرد قلبی در طول دوره‌های ایسکمی و بازگشت پرفیوژن درگروه تست نشان‌دهنده درجاتی از تطابق دراین شرایط می‌باشد که احتمالاً از طریق تأثیر سیانید در مکانیسم‌های متابولیک داخل سلولی ایجاد شده است . درمجموع این مطالعه نشان داد که سیانید می‌تواند به‌عنوان عاملی مناسب برای القای مقاوم‌سازی نسبت به ایسکمی درقلب مطرح باشد. باتوجه به اهمیت موضوع و مصارف احتمالی بالینی آن و همچنین برای مشخص‌شدن دقیق مکانیسم‌های سلولی و مولکولی دراین باره مطالعات تکمیلی‌پیشنهاد‌می‌گردد.

تشکر و قدردانی:

بدین‌وسیله از سرکارخانم‌ها دکترمریم الماسی، دکتر ثمینا رضوانی ، دکتر بهیه‌مرادی و دکتر روناک نعلینی که در انجام دادن مراحل مقدماتی این پروژه ما را یاری دادند، صمیمانه قدردانی به‌عمل می‌آید.